一种用于ASFV双基因缺失鉴别诊断的三重实时荧光定量PCR方法。
深圳海关公布了一种用于非洲猪瘟病毒MGF_360-14L和CD2v双基因缺失鉴别诊断的三重实时荧光定量PCR方法，具体信息如下。
一该方法的简介
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的家猪和野猪的一种传染病。在本研究中，作者建立了一种三重实时定量PCR方法来检测和区分基因双缺失的ASFV株和野生型ASFV株。
本方法中，设计了3对引物和探针，分别针对B646L基因(p72)、MGF_360-14L基因(位于MGF360-505R基因中间)和CD2v基因的保守区。该方法特异性良好，可将基因缺失(MGF360-505R和/或CD2v基因缺失)和野生型ASFV株与PCV2、CSFV、PRRSV、FMDV、SVA或其他病原的核酸相互区分开。含B646L基因、MGF_-14L基因和CD2v基因的标准质粒DNA的检测限分别为7.9拷贝、9.7拷贝和9.6拷贝。
采用OIE推荐的三重rPCR和本文建立的实时定量PCR方法对1215份样品进行了平行检测，两种方法的B646L基因检测结果完全一致。成功地建立了三重定量PCR检测方法，用于鉴定感染ASFV野毒株或感染ASFV双基因缺失毒株的猪只。
二该方法的特点
2.1 基因缺失的ASFV减毒疫苗已成为最有前途的ASF候选商品疫苗;
2.2 区分野生型ASFV和疫苗毒株的试验方法对ASF的预防和控制至关重要;
2.3 本文采用三重实时荧光定量PCR方法检测ASFV基因组中B646L基因、MGF_360-14L基因和CD2v基因;
2.4 三重荧光定量PCR法具有良好的特异性和敏感性。
三该方法的实施
3.1引物
3.2 反应体系
最终的荧光定量PCR混合物含有THUNDERBIRD探针qPCR混合物(包括dNTPs、Mg2+、rTaq
DNA聚合酶)、正向和反向引物各0.5μL(每个引物的最终浓度为200 nM)、TaqMan探针各0.3μL(最终浓度为120
nM)、DNA模板5μL，并用无核酸酶水配制至25μL。
3.3 反应条件
在合适的荧光定量仪器上可以进行荧光定量PCR反应，反应条件是如下：95°C 40 s，然后40个循环：95°C 8 s，58°C 45
s。在58°C下检测荧光信号。
